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HPLC- und Qualitätstipps

HPLC- und Qualitätstipps

Die Tücken der HPLC - Analytik sind jedem Analytiker bekannt. Ob es sich um Probleme mit dem Gerät oder um Trennprobleme handelt, in der täglichen Laborpraxis tauchen immer wieder Fehler und Schwierigkeiten auf. Die HPLC - Tipps geben dem Anwender praxisorientierte Hilfestellungen zu den

vielseitigen Problemen rund um die HPLC. Der Qualitätstipp beleuchtet Themenstellungen vor allem aus dem regulierten Laborumfeld. Hierbei sollen Hilfestellungen für die tägliche Praxis rund um das Thema "Qualität & GMP in der Analytik" gegeben werden.

Unsere Autoren:

Dr. Stavros Kromidas wurde nach langjähriger Tätigkeit im Verkauf von Waters Chromatographie Inhaber und Geschäftsführer der NOVIA GmbH, später selbstständiger Berater und Dozent. Der promovierte Chemiker arbeitet seit 1978 auf dem Gebiet der Chromatographie und hat seit 1984 zahlreiche Trainingskurse und Workshops zur HPLC, Qualität in der Analytik und Validierung geleitet. Er ist Autor und Herausgeber einer Reihe außerordentlich erfolgreicher Bücher.

Seine Seminare zu den oben genannten Themenfeldern sind jedes Jahr fester Bestandteil unseres Seminarprogramms.

               

Michael Baldus ist seit vielen Jahren schon mit an Bord der NOVIA GmbH. Seine NOVIA-Qualitätstipps in unserem Newsletter sowie seine Seminare zu den Themengebieten GMP & Compliance sind wichtige Komponenten der NOVIA-Qualität.

Derzeit absolviert er sein Masterstudium im Studienfach "Business Coaching und Change Management".

HPLC-Tipp

 

Der HPLC-Tipp im November
Ist es vorteilhaft für mich, diesen Parameter zu erhöhen?  

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender,

dieses Mal dreht sich bei unserem HPLC-Tipp alles um die Parameter.

Dr. Stavros Kromidas, www.kromidas.de

Der Fall

Selten sind Eigenschaften eindeutig nur als positiv oder als negativ zu bezeichnen. So hat ein Ferrari zweifelsohne Vorteile. Wenn ich allerdings mit diesem Vehikel und mit meinen vier Kindern und mit meiner Schwiegermutter und mit unserem Hund Mitte August nach Griechenland fahren will, wird es gelinde gesagt mindestens „interessant“…Genauso verhält es sich mit Änderungen. Sie bescheren selten nur „gute“ oder nur „schlechte“ Ergebnisse, so auch in der HPLC: Wenn ich einen Parameter verändere, ergeben sich je nach Betrachtungsweise bzw. Anforderungen Vor- oder eben Nachteile. Nachfolgend eine Auflistung von sechs physikalischen Parametern mit einer differenzierten Betrachtung deren Auswirkungen.

Die Lösung

Statt dem Eluenten können die Zusätze der Probelösung zugesetzt werden. Somit kann man schnell prüfen, ob jenes Modifier zur erhofften Verbesserung führt: Symmetrische Peaks bzw. Verstärkung von hydrophoben Wechselwirkungen im Falle von stark polaren Komponenten. Durch die geringe Konzentration gestaltet sich die anschließende Regenerierung der Säule schnell. Es zeigt sich, dass lediglich die „Manipulation“ der Probelösung als schneller Optimierungsschritt evtl. ausreicht oder aber man erfährt wenigstens, ob dies ein richtiger Weg sein kann. Wenn ja, kann dieser Modifier zukünftig der mobilen Phase zugesetzt werden. Nachfolgend finden Sie eine Auflistung von Zusätzen/Modifiern für die Probelösung für bestimmte Fragestellungen in der RP-HPLC inkl. kurzer Kommentierung.

Was

Nachteile

Vorteile

Erhöhter Druck

Pumpe steigt häufig(er) aus, erhöhte Gefahr von Leckagen, Lebensdauer der Säule nimmt ab, größerer Verschleiß an Dichtungen

Ab ca. 800 bar (UHPLC-Trennungen) mögliche Änderung der Polarisierbarkeit von polaren Molekülen und somit Änderung der Selektivität, häufig Verbesserung

Erhöhung des Flusses

Erhöhung des Druckes (siehe dort), Abnahme der Peakfläche bei konzentrationsabhängigen Detektoren, Abnahme der Auflösung bei isokratischen Trennungen

Abnahme der Retentionszeit, Erhöhung des Gradientenvolumens bei Gradientenläufen und folglich (oft) Verbesserung der Auflösung/Peakkapazität

Erhöhung der Säulenlänge

Längere Retentionszeiten, Erhöhung des Druckes (siehe dort)

Erhöhung der Effizienz (Bodenzahl), beste Möglichkeit für eine ultimative Peakkapazität

Erhöhung des Säulen-innendurchmessers

Breite(re) Peaks, Abnahme der Empfindlichkeit, höherer Eluentenverbrauch, längere Retentionszeiten, Verschlechterung der Trennung bei Gradientenläufen

Abnahme des Druckes, durch die erhöhte Menge an stationärer Phase in der Säule größeres Porenvolumen, was bei der SEC/GPC (Ausschlusschromatographie) enorme Vorteile mit sich bringt

Erhöhung des Partikeldurchmessers

Bei isokratischen Trennungen evtl. merkliche, bei Gradiententrennungen eher marginale Verschlechterung der Trennung aufgrund von Peakverbreiterung

Robuste(re) Säulen und geringerer Druck, somit erhöhte Lebensdauer der Säule, preisgünstiger, geringe Korngrößenverteilung, somit homogenere Packung und folglich symmetrische(re) Peaks

Größeres Verweilvolumen beim Gradienten (dwell/delay volume)

Längere Retentionszeiten

Ein solches kann (nicht Muss!) Auflösung, Peakform, Selektivität, Elutionsreihenfolge beeinflussen – in welche Richtung auch immer…

Das Fazit

Man sollte die Auswirkungen bei der Veränderung eines Parameters in Gänze betrachten und den für die aktuelle Fragestellung sich ergebenden Vor- bzw. Nachteil erkennen. Es seien hier nur drei Beispiele genannt:

  • Größerer Innendurchmesser; betreibe ich RP-HPLC oder SEC?
  • Längere Säule; für eine komplexe Probe/Matrix ein unabdingbares „Muss“, die lange Retentionszeit muss in kauf genommen werden; für 3-5 Peaks ist eine lange Säule vermutlich die „falsche“ Wahl
  • Höherer Druck und somit geringe Lebensdauer der Säule; zwar eine richtige Aussage, bedenke jedoch: Was in der Regel „zählt“ ist nicht die Lebensdauer der Säule absolut sondern die Anzahl der Trennungen pro Zeiteinheit

(PS. Übrigens: Meine Frau ist an jenem August geflogen…)

Qualitätstipp

NOVIA Qualitätstipp

Die Provadis NOVIA Qualitätstipp-Videoreihe ist gestartet! Ab sofort hält Sie unser Trainer Herr Michael Baldus zu vielseitigen Fragestellungen im Themenbereich Qualität auf dem Laufenden.

Die Dokumentation ist das Herzstück in der GMP-Welt. „Was nicht dokumentiert ist, gilt als nicht gemacht“, heißt es hierbei immer wieder. Unser Trainer Michael Baldus erläutert Ihnen im aktuellen Qualitätstipp-Video, warum die Dokumentation so wichtig ist.

Archiv HPLC-Tipps

Sie wünschen sich einen Einblick in HPLC-Tipps aus vorherigen Erscheinungsjahren? Kein Problem! Kontaktieren Sie uns und wir stellen Ihnen diese gerne zu Verfügung.